cffDNA در هفته 7 بارداري در خون مادر ظاهر شده و بلافاصله بعد از تولد از گردش خون وي پاک مي شود، طوري که 2 ساعت پس از زايمان ديگر در خون مادر قابل تشخيص نمي باشد. از نظر سايز اين مولکول خيلي کوچکتر از cell free maternal DNA بوده و سايزي در حدود 200-300 bp دارد و اين خاصيت اساس بسياري از تکنيکهاي افتراق cffDNA از cell free maternal DNA را تشکيل مي دهد.

البته بعضي از تکنيکهاي قديمتر از اختلافات موجود در نواحي اپي ژنيک cffDNA از cell free maternal DNA (مثل unmethylation index of the phosphodiesterases gene 9A و methylated DNA immunoprecipitation) استفاده مي کنند. از آنجائيکه افتراق cffDNA از ميان مقدار بالاي cell free maternal DNA نياز به تکنيک بسيار حساس و با دقت بالايي دارد بنابراين بايد از تکنيک هاي بسيار پيشرفته که جهت آناليز مولکولي مورد استفاده قرار مي گيرد (مانند digital PCR و Massively Parallel Sequencing = MPS) براي تشخيص و جداسازي cffDNA استفاده کنند.

کاربرد cffDNA در زمينه هاي ذيل مي باشد:
1- تشخيص non-compatible RhD factors

2- تشخيص sex determination for X-linked genetic disorders

سردسته اين بيماريها عبارتند از: fragile X Syndrome، Duchenne muscular dystrophy، Hemophilia، بيماري Congenital Adrenal Hyperplasia (بدليل مهار توليد کورتيکواستروئيدها هورمونهاي آندروژن افزايش يافته و اگر جنين دختر باشد باعث مردانه شدن اندام تناسلي خارجي شده و در نتيجه بايد از هفته 7 بارداري درمان با دگزامتازون را براي جنين هاي دختر شروع کرد و مانع از ترشح آندروژنها شد).

3- testing for single gene disorders

4- determining aneuploidies

- ارزش پيشگوئي کننده مثبت (Positive Predictive Value) تست cffDNA براي بررسي تريزومي 21، 5/45% در مقابل 2/4% تست هاي روتين غربالگري سه ماهه اول براي سندرم داون مي باشد. اين ميزان در تريزومي 18، 0/40% در مقابل 3/8% تست هاي روتين غربالگري سه ماهه اول مي باشد. در مطالعه دکتر Lewis در سال 2014 مشخص گرديد که ميزان مثبت کاذب براي سندرم داون يا تريزومي 21، 3/0% در مقابل 6/3% تست هاي روتين غربالگري سه ماهه اول و براي سندرم ادوارد يا تريزومي 18، 2/0% در مقابل 6/0% تست هاي روتين غربالگري سه ماهه اول مي باشد.

طبق توصيه دسامبر 2012 ACOG و انجمن طب مادر و جنين در مورد تست cffDNA، بايد به نکات ذيل توجه نمود:

-  تست Cell Free Fetal DNA تشخيصي نبوده و جايگزين CVS و آمنيوسنتز نمي باشد.

-  قدرت تشخيص اين تست براي تريزومي ??، ??? است (مثبت کاذب کمتر از ?/? درصد). توجه: در مطالعات مختلف گزارشات بسيار متناقضي از قدرت تشخيص تست ارائه شده است بطور مثال در مطالعه دکتر ليم و همکاران در سال 2011 قدرت تشخيص 3/83% (15 مورد از 18 مورد داون تشخيص داده شد)، در مطالعه دکتر پالوماکي و همکاران در سال 2011 قدرت تشخيص 6/98% (209 مورد از 212 مورد داون تشخيص داده شد)، در مطالعه دکتر دنگ و همکاران در سال 2011 قدرت تشخيص 8/95% (23 مورد از 24 مورد داون تشخيص داده شد) و در مطالعه دکتر دان و همکاران در سال 2012 قدرت تشخيص 100% (139 مورد از 139 مورد داون تشخيص داده شد) گزارش شده است.

-  قدرت تشخيص آن براي تريزومي 18، 98-97% و براي تريزومي 13، 80-79% مي باشد (مثبت کاذب کمتر از 1 درصد).

-  بيمار با يک تست مثبت بايد براي مشاوره ژنتيک و انجام تست هاي تشخيصي جهت تائيد نتيجه اين تست ارجاع داده شود. 

-  يک نتيجه منفي به معني اطمينان کامل از سلامت جنين از نظر سندرم داون نيست.

-  اين تست بايد صرفأ به گروه‌هاي زير توصيه شود:

-  زنان 35 سال يا بالاتر

-  وجود يک تست غربالگري مثبت ازجمله تست هاي غربالگري سه ماهه اول، دوم، اينتگريتد و يا سکوئنشيال

-  يافته سونوگرافيکي که نشان دهنده افزايش ريسک اختلالات آنوپلوئيدي مي باشد.

-  وجود سابقه قبلي براي وجود تريزومي ها

-  وجود يک Parental balanced robertsonian translocation که سبب افزايش ريسک تريزومي 13 و 21 در جنين مي شود.

-  اين تست نبايد به گروه کم خطر و يا زنان باردار دو قلو به بالا پيشنهاد شود چرا که اين تست به اندازه کافي در اين دو گروه مورد ارزيابي قرار نگرفته است.

-  اين تست قادر به تشخيص فرمهاي موزائيسم، partial chromosome aneuploidy، ترانسولوکيشن و يا آنوپلوئيدي هاي مادري نمي باشد.

-  اگر يک آنومالي ساختاري در سونوگرافي جنين مشاهده شود بايد بيمار مستقيماٌ براي انجام تست هاي تهاجمي تشخيصي ارجاع داده شود.

قبل از انجام تست بايد سابقه خانوادگي گرفته شود تا مشخص شود آيا نياز به انجام ساير تست هاي غربالگري و يا تشخيصي است يا خير.

دکتر مارک ليچ در سال 2013 گزارش نمود که در واقع DNA که در اين روش مورد بررسي قرار مي گيرد DNA جنين نبوده بلکه DNA جفتي مي باشد. بدين علت که در جنين شناسي مي دانيم وقتي که گامت بارور شده در لايه آندومتر لانه گزيني مي کند و شروع به تقسيم سلولي مي کند در اولين تقسيمات سلولي يک سري سلولهاي مختلف که در آينده عملکرد مختلفي دارند تشکيل مي شود که عبارتند از:
1- يک سري سلولها جنين را تشکيل مي دهد.

2- يک سري سلولها در آينده جفت را تشکيل داده و به آن سيتوتروفوبلاست (Cytotrophoblast) مي گويند.

3- يک سري سلولها هم به صورت يک لنگر باعث اتصال جنين و جفت به جدار رحمي مادر مي شود که به آن سلولهاي سن سيتيوتروفوبلاست (Syncytiotrophoblast) مي گويند.

بنابراين در واقع تقريبأ تمام cffDNA که در خون مادر ديده مي شود، در واقع منشاء آن از سلولهاي جفت بوده و نه جنين و بهتر است به آن cell free placental DNA بگوئيم. بنابراين در مواقعي که موزائيسم جفتي وجود دارد ( confined placental mosaicism زماني ايجاد مي شود که سه تايي شدن کروموزوم در بعضي سلولهاي تشکيل دهنده جفت ديده مي شود، در حاليکه سلولهاي ديگر از جمله سلولهاي جنين نرمال بوده) به همين علت مي تواند ايجاد مثبت کاذب نمايد (درست مانند مشکلي که در CVS ديده مي شود و در نتيجه براي تأئيد تشخيص نياز به آمنيوسنتز داريم). اين وضعيت در 2-1% بارداري ها ديده مي شود و در نتيجه وضعيت تقريبأ شايعي است.

هرچند cffDNA ممکن است متمايز از cell free placental DNA باشد اما در قسمت اعظم موارد، صحت نتايج آن بسيار خوب است، در حاليکه توجه به تفاوت مفهومي بين اين دو اصطلاح ضروري است. به همين دليل است که اين تست هرچند صحت بالايي دارد ولي قدرت کافي براي تصميم گيري بدون انجام تست هاي تشخيصي مثل آمنيوسنتز را ندارد.

دکتر کاگان و همکاران در سال 2014 توصيه نمودند ترکيب تست غربالگري سه ماهه اول و NIPT با هم قدرت تشخيص 97% و مثبت کاذب 1% براي اختلالات کروموزومي بدست مي دهد. از اين تست براي تعيين جنسيت و بررسي اختلالات کروموزومهاي جنسي (مثل سندرم ترنر، کلاين فلتر و ...) هم استفاده مي شود هرچند مستلزم صرف هزينه بيشتر بوده و در ضمن قدرت تشخيص آن براي کروموزومهاي جنسي هنوز نياز دارد که ارزيابي بيشتري در مورد آن انجام شود.
 
دکتر اوانس و همکاران در سال 2014، گزارش نمودند که در استراتژي انجام تست cffDNA براي تمام زنان باردار براي هر بيمار بسيار گرانتر (حدود 1017 دلار) از روش انجام غربالگري سه ماهه اول و سپس انجام cffDNA براي گروه پرخطر مي باشد که به آن روش مرحله به مرحله يا contingent (حدود 409 دلار). به عبارت ديگر هزينه حاشيه اي براي تشخيص يک مورد سندرم داون در استراتژي انجام تست cffDNA براي تمام زنان باردار حدود 3 الي 16 برابر بيشتر از روش هاي مرحله به مرحله مي باشد.

دکتر کلارک گاناهارت و همکاران در سال 2014، دو مورد از موارد مثبت کاذب اين تست را گزارش نمودند: يک مورد تست از نظر تريزومي 18 مثبت شد در حاليکه نشان دهنده فرم موزائيسم تريزومي 18 در جفت بوده و جنين سالم بوده و يک مورد از نظر تريزومي 13 مثبت شد ولي در آمنيوسنتز کروموزوم 8p duplication/deletion بدست آمد